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亮氨酸氨基肽酶(Leucine Aminopeptidase, LAP) 試劑盒說明書

更新時(shí)間:2025-01-11      瀏覽次數(shù):265

亮氨酸氨基肽酶(Leucine Aminopeptidase, LAP

 

試劑盒說明書

分光光度法 50 /48 

 

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義:

LAP 是一類能水解肽鏈N-末端為亮氨酸的酶,廣泛存在于肝、腎、胰等組織中,尤其以肝臟中含量最為豐富。各類肝病患者因肝細(xì)胞損傷,血清LAP 的活性均有不同程度的升高,因此,血清 LAP 活性的檢測(cè)能從不同側(cè)面反映各種肝病的發(fā)生和發(fā)展。

測(cè)定原理:

LAP 分解L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺生成對(duì)硝基苯胺,后者在 405nm 有最大吸收峰,通過測(cè)定吸光值升高速率來計(jì)算LAP 活性。

組成:

 

產(chǎn)品名稱

BH6005-50T/48S

Storage

提取液:液體

50ml

4

試劑一:液體

40ml

4

試劑二:粉劑

1

-20

說明書

1 

自備儀器和用品:

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前理:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(ml 1000~50001 的比例(建議 2000 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1ml 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

LAP 測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 405nm,蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解(如較難溶解,可 50℃水浴加熱約 30min 促進(jìn)溶解); 37

(哺乳動(dòng)物) 25℃(其它物種)水浴 10min 以上;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 250μl 樣本和 750μl 試劑一,混勻后立即記錄 405nm 處初始吸光值A1 2min 后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A2-A1

 

注意事項(xiàng):若ΔA 大于 0.5,需將酶液用提取液稀釋,計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。使 A2-A1 小于

0.5,可提高檢測(cè)靈敏度。

LAP 活力單位的計(jì)算:

1、血清(漿)LAP 活力的計(jì)算:

單位的定義:每ml 血清(漿)每分鐘生成 1 nmol 的對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAPnmol/min/ml)=[ΔA×V 反總÷(ε×d×109]÷V ÷T=205.8×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中LAP 活力的計(jì)算:

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAPnmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g 組織每分鐘生成 1 nmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAPnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAPnmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d×109]÷(2000×V ÷V 樣總) ÷T=0.103×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,1×10-3 L;ε:對(duì)硝基苯胺摩爾消光系數(shù),9.72×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.25 ml;V 樣總:加入提取液體積,1 ml;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g;2000:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),2000 萬。


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